Nattviol är en upp till tre decimeter hög orkidé med vitaktiga blommor. Den har två stora ovala blad som sitter långt ner på stjälken, samt två eller tre små och smala stjälkblad.
Nattviol blommar i juni-juli med väldoftande blommor som sitter samlade i mångblommiga ax, blommorna doftar starkare på kvällen och lockar då till sig svärmare som pollinerar dem.
Kalkbladen är vita till gul- eller grönvita. Blomman har en långsmal läpp och lång och tunn sporre. Pollenfacken sitter tätt och parallellt. Nattviol delas upp i två underarter,
ängsnattviol (ssp. bifolia) och skogsnattviol (ssp. latiflora (Drejer) Löjtnant). Skogsnattviol är grövre med glesare blomställning och längre sporre. Hos ängsnattviol är sporren ungefär två
centimeter lång, medan den hos skogsnattviol är omkring tre centimeter lång.
